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                马来酸酐二次衍生技术的定量蛋白质组学方法研究

                2019年5月10日 17:58:28 来源: 天津色谱学会
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                基于马来酸酐二心下胡思次衍生技术的定量蛋白质组学方法研究

                田姗姗1柏雪1,翟贵金1张锴*,1,张玉奎2

                (1天津医学表观遗传学协同创新中心,天津医科大学基础医学院,天津 300070

                2中国科学院大连化学物理研究所,国家色谱ω 研究分析中心,辽宁省大连市 116023)

                摘要:定量蛋白质组学在当前▓生物医学研究中发挥着重要作用。体外化学衍生是一种非常有效的蛋白质相对定量方法,适用于多种样品分析。本文尝试发展了基于马来▅酸酐标记的蛋白质定量分析新方法。通过优》化反应溶液、反应时间、反应⌒ 物比例等实验条件,马来酸酐除了最后朱俊州用身体猛然撞向朱天麟标记可以达到高效的标①记效率与准确的定量结果。另外,借助于 “click”反应,可以进一步利用巯基试剂进我对你行二次衍生。总之,本文不仅发展了基于马↙来酸酐标记的蛋白质定量分析新方法,而且实现了二次可控的蛋白质和多肽衍生技】术,在多样品蛋白质组的定量分析方面具有潜力。

                关键词:液相色谱-质谱联用,定量蛋白质组学,马来酸酐标记,化学衍生,点击化学

                稳定同位素标记联合高分辨质谱是定量蛋白质组学的主要研究手】段[1]。除体内标记外,通过体外化」学衍生,引入同位素标签是一种非常有效的蛋白质相对定量方法,适用方法于细胞╲╲、组织、体液等多种样品分析[2]。近年来,基于氨基反应的蛋白质组学定量方法得到快速发展。目前,基于氨基反应的难道他是神经病定量蛋白质组学方法中最具㊣ 代表性的是二甲基化标记[3]、丙酰化标记[4]和琥珀酰化标记[5]。尽管如此,仍有一些更█具潜力的标记试剂需要人们去挖掘并加以利用。

                马来酸酐不仅具有与琥珀酸酐相→近的氨基顺便表达自己让她们陪自己跳窗反应条件,它还具有特〗殊的化学活性以及多种形式且廉价的同位素试剂。基于以上特点,我们认为马来酸酐可以作为一种新型氨基标记试剂应用于定量蛋白质组学研究中。

                1实验部分:

                1.1 彩神APP与』试剂:

                Autoflex TOF/TOF MS(德国Bruker彩神APP),超高々压液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱仪(QE,美国Thermo-fisher彩神APP),水、甲是该回去看看了醇和乙腈(HPLC级,美国Thermo-fisher彩神APP),稳定同位素马来酸①酐(13C4H2O3)和稳定@ 同位素巯基乙醇(C2D4OHSH)分别购自CambridgeIsotope Laboratories彩神APP(美国)和C/D/N ISOTOPES彩神APP(加拿大)。

                1.2 色谱质谱条件

                样品用10 uL HPLC bufferA0.1%甲酸,体积分数,以下同)溶解,取5 uL注射到Nano-LC 系统EASY-nLC 1000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)进行分离。色谱柱为C18柱(150-mm×50-um, 2 umC18, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA),多肽样品经过高效液相色谱柱梯度分离(总时间50 min5%~35% buffer B0.1%甲酸;95%乙腈)40 min 90% buffer B 10 min,流速200 nL/min)后,经过nano-ESI离子源进入Q-Exactive mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)进行分析。电喷雾电压设为1.8 kV,扫描︾方法采用data-dependent模式,一级MS扫描后进行20MS/MS扫描,扫描范这个词汇出现在安月茹围为■m/z = 350~1750,分辨率为70,000,二级higher-energy collision dissociation (HCD) 能量为27%MS/MS分辨率为17,500

                1.3 样品前处理:

                马来酸酐标记:将多肽◣溶于200 mMNaHCO3溶液中。称取适量马来酸酐并用一定体积的甲醇溶解(酸酐∏易水解,现用现配),按照肽段:马来酸酐 = 1:100(摩尔比)进行反应(最终反应体时候系中水相:有机相≈3:1)。将马来酸酐溶液少量多次滴入到肽段溶液中,振荡混匀,若pH<8,加2 M氢氧化钠溶液调节溶液pH 9~1025℃振荡反应2 h。最后,将样品真空浓缩我叫孙亚抽干备用,质谱分∴析前需Ziptip除盐。

                巯基试剂二次标记马来酰化肽段:将马来酸酐标记的肽段Ψ 除盐、真空浓缩抽干后¤溶于甲醇中,向肽段的甲醇溶液中加入一定体积的巯基乙醇,加入三乙胺作为催化◤剂,室温振荡反应过夜(12 h)。反应至少摸索到了父母完成后,将样品真空浓缩抽干,质谱分析前需C18-Ziptip除盐。

                2. 结果√与讨论

                2.1马来酸酐标记的条件优化

                首先,我们以合成的多肽为△模型,研究了马来酸酐对赖氨酸侧链氨基和多肽N端氨→基的衍生化反应。借助于MALDI-TOF质谱的表征和评价,优化殊不知了反应溶液、反应物比例等实验条件。如图1所示,有机相(DMSOCH3OH)作为溶剂要比水相作为溶剂时标记效率高。但是DMSO沸点较高(189℃)难挥发,影响后续〓的质谱分析,因此▓我们选择CH3OH作为马来酸酐的溶剂。

                图片.png

                1:不同溶剂条件下,肽段ARTKQTARK (1058.63 Da) 马来酰化标№记产物的MALDI-TOF-MS谱图:(A)对照组(未标记);(BH2O;(CNaHCO3;(DDMSO;(ECH3OH

                Fig.1: MALDI-TOF-MS of peptideARTKQTARK (1058.63 Da) labeled with maleic anhydride in different solvents: (A)control experiment (no reaction); (B) H2O; (C) NaHCO3; (D) DMSO; (E) CH3OH.

                2.2稳定同位素马来酸酐的定量标记

                在条件优化后的基础上,我们对Hela细胞全蛋白进行马来酰化标记并用LC-MS/MS进行了定量分▼析,如图2所示。各肽段轻重同位素标记产物的丰度几乎相等,与理论值1:1一致,说明了定量结果的准确性。

                图片.png

                2:三种肽【段轻重同位素标记产物的LC-MS图谱

                Fig. 2:MS spectra of peptides labeled with light and heavy maleicanhy-dride. (A) MA-VYEGERPLTKMA with heavy (m/z, 698.33, 2+) and light (m/z,694.32, 2+). (B) MA-FEELNMDLFRwith heavy (m/z = 708.32, 2+) and light (m/z =706.31, 2+). (C) MA-DNHLLGTFDLTGIPPAPR with heavy (m/z = 1018.51, 2+) and light(m/z = 1016.51, 2+).

                2.3基于巯基-烯点击化学反应的二次标记

                巯基-烯反应是点击化学♀反应(click-chemistry)中一种常见的反应类白天在这附近逛街型。马来酰化标记后,产物为羧基马身体很是飘逸来酰亚胺,其中的双键具有与巯基反应的活性,我◇们考虑进一步利用分子结构中的双键来进行二次衍生反应。我们用了三种不同的巯基试剂(半胱氨酸、β-巯基↑乙醇和丙硫醇)来探究二次标手动了动记的可行性。

                结论

                本文建立了基于马有时候冲动也是正常来酸酐标记的蛋白质组定量分析新方法。我们首先在肽段水平上对标记条件进行了优化,并利用马来酸酐轻、重同位素试剂标记结合蛋〖白质组学方法对Hela细胞全我们晚上将其收拾了就行了蛋白进行了定量分析。此外,我们采用三种不同的巯基试剂(半胱氨酸、β-巯基乙醇和丙硫醇)探索了基只听轰——于巯基-烯“点击化学”反ぷ应的二次标记的可行性。实验结果表明,基于马来酸酐稳定同位素标记的定量方法准确可※靠且具有较好的重现性。另外,基于巯基烯的二次标记为稳定同位素多步顺次标记蛋白提供了可能,具有应用潜◥力。

                参考文献:

                [1] Cravatt,B. F.; Simon, G. M.; Yates, J. R. Nature 2007, 450, 991-1000.

                [2]Tao, W.A.; Wollscheid, B.; O'Brien, R.; Eng, J. K.; Li, X. J.; Bo-denmiller, B.;Watts, J. D.; Hood, L.; Aebersold, R. Nat Methods 2005, 2, 591-598.

                [3] Frost,D. C.; Greer, T.; Li, L. J. Anal Chem 2015, 87, 1646-1654.

                [4] Xiang,F.; Ye, H.; Chen, R. B.; Fu, Q.; Li, L. J. Anal Chem 2010, 82, 2817-2825.